生質能源新希望-淺談CRISPR/Cas9基因編輯新技術
王釿鋊主任、許湘琴組長
前言
在綠色能源中，生質能源的取之不盡用之不竭，以及轉換過程中零碳排放的特性，在環境能源永續發展中，一直佔有相當重要的位置，但各國在發展生質能源產業上，也面臨了一些爭議與挑戰，如能量密度偏低、與糧爭地、成本過高等等，一再使生質能源的發展受到不少限制，遲遲無法跟其他新興潔淨能源相競爭。
近年備受關注的CRISPR/Cas9基因技術是一個非常強大的DNA編輯工具，不但能幫助人們更深入了解生命體運作機制，更可進一步經由基因體編輯，突破過往冗長的雜交育種程序，成為目前最受矚目，也發展最快的基因工程技術。
而CRISPR/Cas9基因技術是如何運作的?其實這也是仿生技術之一，生命體除了具有自我修復功能外，還有一套能抵制外來病毒與細菌的免疫系統機制，而小至細菌也同樣有此功能。其中一個存在於細菌與古細菌中的後天免疫機制，就是所謂的CRISPR/Cas系統，此系統有兩個關鍵組成，一個是CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，這段序列是由相同的重複序列 (repeat) 和不同的間隔序列 (spacer) 不斷重複所形成的；另一個是Cas (CRISPR associated proteins)，是一種核酸酶 (nuclease)，CRISPR基因座 (locus) 結構如圖1。
圖1 CRISPR基因座結構 (來源:轉譯自Welgene Biotech Co., Ltd.)。
整個運作機制是當每次有外來病毒入侵時，如果細菌存活下來，便會把病毒遺留的 DNA 片段加到自己的 CRISPR序列中成為一段 spacer留下紀錄，所以 spacer 記載了不同病毒的基因片段序列，且越新捕獲的病毒序列，就會越靠近前導序列 (leader sequence)，有越早做比對的作用，當下一次遭受到曾記載過的病毒侵略時，CRISPR/Cas系統會自動將此病毒的DNA轉錄成RNA型式來做比對，稱之為CRISPR RNA (crRNA)，有時還會需要另一段特別的RNA來調控crRNA活性，稱之為trans-activating RNA (tracrRNA)，來幫助尋找病毒的DNA，兩個RNA結合成一個guide RNA (gRNA)，找到互補的病毒DNA後形成一個標示，誘導Cas進行水解，達到防禦效果，這就是整個免疫系統基本的運作方式(如圖2)。
圖2 CRISPR/Cas系統運作機制。
不同細菌種類，所擁有的CRISPR/Cas系統不盡全然相同，大致上可粗分為Type I、II和III三大類型，Type I 與 Type II 的作用目標為DNA，而 Type III的目標則為DNA 與 (或) RNA。Type I與Type III兩者都只需要 crRNA 就可以辨識病毒 DNA，但須多種Cas參與，並先形成一個複雜的蛋白複合體 (Cascade-like complex) 來辨識與分解病毒DNA；Type II的機制較為簡易些，僅須透過Cas9核酸內切酶 (endonuclease) 結合crRNA與tracrRNA形成的複合體，就可以進行辨識與分解功能，亦稱之為CRISPR/Cas9系統，當今生技領域最受關注並寄予厚望的基因編輯技術就是從此系統衍生而來的。
而目前CRISPR/Cas9基因編輯技術，主要是透過一個來自於化膿性鏈球菌 (Streptococcus pyogenes) 的 Cas9 核酸內切酶與crRNA與tracrRNA形成的複合體，藉由tracrRNA以及設計與目標序列互補的crRNA黏合為一單股RNA，稱為single guide RNA (sgRNA)，引導Cas9核酸內切酶到DNA序列中想要進行編輯的位置進行編輯。
1.可應用層面廣：此技術並無物種的限制，舉凡從微生物、植物到動物，皆可藉由此技術達到優化動物和作物育種的目標。
2.製程簡單：只須對兩種RNA進行人工設計，即可對欲修改的基因序列標的進行編輯。
3.準確性高：以往的編輯工具無法很準確定位，但此技術利用DNA與RNA鹼基互補配對原則，提高定位與編輯準確率。
4.時程短：撇開過去傳統育種，動輒耗費數年不說，早期的基因編輯技術，用來標的蛋白質不易製作，且實驗流程繁複，往往需耗時一年多，而此技術平均數周即達到相同的結果，大幅縮減基因編輯時間。
5.成本低：由於製程簡單且時程短，再加上製作材料所需成本較傳統方法為低，故此技術成本相對於其他基因編輯技術便宜很多。哈佛基因學家 George Church曾表示，成立一間 CRISPR 實驗室只需二千美元，而實驗成本甚至低至一百美元。
由此可知，CRISPR/Cas9基因編輯技術，應用層面相當廣泛，如修正導致疾病之基因、農作物改良等等，目前更不乏有科學家利用CRISPR技術針對能源作物或藻類、菌類等微生物進行編輯研究，如提高光合作用效率、增加含油量、縮短工業製程…等等。其中，最具商業化量產的案例莫過於石油巨擘ExxonMobil與合成基因組公司（Synthetic Genomics）合作的綠藻產油計畫。
合成基因組公司的創辦人大有來頭，Craig Venter是全球第一位破解人類基因序列之科學家，同時也是全球第一個人造生命細胞的創造者，他帶領的研究團隊自2009 年即開始合作研究藻類生質燃料，直至2017年，應用了CRISPR/Cas9基因編輯技術，有了很大的突破，成功創造出一種富含石油的藻類，從原本20%的脂質含量，提升到40-55%的脂質含量，可謂藻類生產生質燃料的大突破，更為商業化量產帶來曙光。
2018年，兩家公司更進一步在加州設置了戶外實地研究場域，對後續量產與商業化做準備，並積極對外公布將於2025年，以藻類產製1萬桶生質燃油的目標。
被譽為神之手般的CRISPR/Cas9基因編輯技術，在短短幾年時間，已在多方面領域累積不少的應用成果，也催生了不少科技新創公司，提供不同的商業模式與技術平台，此技術在未來的進展上，速度只會越來越快，應用範圍將越來越擴大，相信對綠色生質能源的推進是一個很大的助力。
1. 部分內容轉載自中技社通訊秋季刊127期「淺談科技之星-CRISPR/Cas9基因編輯技樹於育種或農業應用」一文。
2. 中技社專題報告2018-11基因體科技於農業及能源之發展。
3. Current Opinion in Biotechnology 2016, 38:79–84
4. https://corporate.exxonmobil.com/en/research-and-innovation/advanced-biofuels/advanced-biofuels-and-algae-research#biofuelsResearchPortfolio
